ДНК амплификация чрез полимеразна верижна реакция

PCR означава полимеразна верижна реакция, техника на молекулярна биология за амплифициране на сегменти от ДНК, чрез генериране на множество копия, използвайки ензими на ДНК полимераза при контролирани условия. Само едно копие на ДНК сегмент или ген може да бъде клонирано в милиони копия, което позволява откриване с помощта на багрила и други техники за визуализация.

Разработен през 1983 г., процесът на PCR направи възможно извършването му ДНК секвениране и идентифицират реда на нуклеотидите в отделните гени. Методът използва термично циклиране или многократно нагряване и охлаждане на реакцията за топене и репликация на ДНК. Докато PCR продължава, „новата“ ДНК се използва като шаблон за репликация и възниква верижна реакция, експонираща амплифицирайки ДНК матрицата.

PCR техники се прилагат в много области на биотехнологиите, включително протеин инженеринг, клониране, криминалистика (отпечатване на ДНК), тестване на бащинство, диагностика на наследствени и / или инфекциозни заболявания и за анализ на проби от околната среда.

По-специално в криминалистиката, PCR е особено полезен, тъй като усилва дори най-малкото количество доказателства за ДНК. PCR може да се използва и за анализ на ДНК, която е на хиляди години, и тези техники са били използвани за идентифициране на всичко - от мамут на 800 000 години до мумии от цял ​​свят.

Тази стъпка е необходима само за ДНК полимерази, които изискват PCR с горещ старт. Реакцията се нагрява до температура между 94 и 96 ° С и се задържа за 1-9 минути.

Ако процедурата не изисква инициализация, денатурацията е първата стъпка. Реакцията се нагрява до 94-98 ° С за 20-30 секунди. Водородните връзки на ДНК шаблона са разрушени и се създават едноверижни ДНК молекули.

Температурата на реакцията е по-ниска до между 50 и 65 ° С и се задържа в продължение на 20-40 секунди. Праймерите се отгряват към едноверижния ДНК шаблон. Температурата е изключително важна по време на тази стъпка. Ако е прекалено горещо, грундът може да не се свърже. Ако е твърде студено, грундът може да се върже несъвършено. Добрата връзка се образува, когато последователността на грундът съвпада точно с последователността на шаблона.

Температурата по време на този етап варира в зависимост от вида на полимеразата. ДНК полимеразата синтезира изцяло нова верига ДНК.

Този етап се провежда при 70-74 ° С в продължение на 5-15 минути след окончателния цикъл на PCR.

Тази стъпка не е задължителна. Температурата се поддържа 4-15 ° С и реакцията се задържа.

По време на всеки цикъл продукт (специфичното парче ДНК, което се репликира) се удвоява.

Тъй като ДНК полимеразата губи активност и консумира реагенти, реакцията се забавя.

Не се натрупва повече продукт.