Как работи полимеразната верижна реакция за усилване на гените

Полимеразната верижна реакция (PCR) е молекулярно-генетична техника за създаване на множество копия на ген и също е част от процеса на генно секвениране.

Геновите копия се правят с помощта на проба от ДНК и технологията е достатъчно добра, за да се направят множество копия от едно единствено копие на гена, открит в пробата. PCR амплификацията на ген за правене на милиони копия, позволява откриване и идентифициране на генни последователности с помощта на визуални техники въз основа на размер и заряд (+ или -) на парчето ДНК.

При контролирани условия малки сегменти от ДНК се генерират от ензими, известни като ДНК полимерази, които добавят допълнителни дезоксинуклеотиди (dNTP) до парче ДНК, известно като "шаблон". Дори по-малки парчета ДНК, наречени "праймери", се използват като отправна точка за полимераза.

Праймерите са малки парчета от ДНК (олигомери), обикновено дълги между 15 и 30 нуклеотиди. Те са направени чрез познаване или предположение за къси последователности на ДНК в самите краища на амплифицирания ген. По време на PCR ДНК, която се секвенира, се нагрява и двойните нишки се разделят. След охлаждане праймерите се свързват с шаблона (наречен отгряване) и създават място за започване на полимеразата.

Полимеразната верижна реакция (PCR) стана възможна чрез откриването на термофили и термофилни полимеразни ензими (ензими, които поддържат структурната цялост и функционалност след нагряване при високи температури). Стъпките, участващи в PCR техниката, са следните:

• Създава се смес с оптимизирани концентрации на ДНК матрицата, полимеразен ензим, праймери и dNTP. Способността да се загрява смес без денатуриране на ензима позволява денатуриране на двойната спирала на ДНК пробата при температури в диапазона от 94 градуса Целзий.
• След денатурация, пробата се охлажда до по-умерен интервал, около 54 градуса, което улеснява отгряването (свързването) на праймерите към едноверижните ДНК шаблони.
• На третия етап от цикъла пробата се загрява до 72 градуса, идеалната температура за Taq ДНК полимераза, за удължаване. По време на удължаването ДНК полимеразата използва оригиналната единична верига ДНК като шаблон за добавяне на допълнителни dNTP до 3 'краищата на всеки праймер и генерира секция от двуверижна ДНК в областта на интересуващия ген.
• Праймерите, които имат отгрята към ДНК последователности, които не са точно съвпадение, не остават отгряти при 72 градуса, като по този начин ограничават удължението до интересуващия ген.

Този процес на денатуриране, отгряване и удължаване се повтаря многократно (30-40) пъти, като по този начин увеличава експоненциално броя на копията на желания ген в сместа. Въпреки че този процес би бил доста досаден, ако се извърши ръчно, пробите могат да бъдат подготвени и инкубирани в програмируем термоциклер, който вече е често срещан в повечето молекулярни лаборатории и може да се извърши пълна PCR реакция 3-4 часа.

Всяка стъпка на денатуриране спира процеса на удължаване на предишния цикъл, като по този начин обрязва новата верига ДНК и я поддържа приблизително до размера на желания ген. Продължителността на цикъла на удължаване може да бъде удължена или по-кратка в зависимост от размера на интересуващия ген, но в крайна сметка, чрез повтарящи се цикли на PCR, по-голямата част от шаблоните ще бъдат ограничени само до размера на интересуващия ген, тъй като те ще бъдат генерирани от продукти и на двата грундове.

Има няколко различни фактори за успешен PCR които могат да бъдат манипулирани за подобряване на резултатите. Най-широко използваният метод за тестване за наличие на PCR продукт е електрофореза с агарозен гел. Което се използва за разделяне на фрагменти от ДНК въз основа на размера и заряда. След това фрагментите се визуализират с помощта на багрила или радиоизотопи.

След откриването на PCR са открити ДНК полимерази, различни от оригиналния Taq. Някои от тях имат по-добра „коректорска“ способност или са по-стабилни при по-високи температури, като по този начин подобряват специфичността на PCR и намаляват грешките от вмъкването на неправилния dNTP.

Някои вариации на PCR са проектирани за специфични приложения и сега се използват редовно в молекулярно-генетични лаборатории. Някои от тях са PCR в реално време и PCR с обратна транскриптаза. Откриването на PCR също е довело до развитието на секвениране на ДНК, т.е. ДНК отпечатък и други молекулярни техники.