Полето на биотехнологиите е една от постоянните промени. Бързият растеж и развитието на авангардни изследвания зависят от иновациите и креативността на учените и способността им да виждат потенциала в основна молекулярна техника и да я прилагат в нова процеси. Появата на полимеразна верижна реакция (PCR) отвори много врати в генетичните изследвания, включително средство за ДНК анализ и идентифициране на различни гени въз основа на техните ДНК последователности. ДНК последователността също зависи от способността ни да използваме гел електрофореза да се отделят нишките на ДНК, които се различават по размер с толкова малко, колкото една базова двойка.
ДНК секвениране
В края на 70-те години на изобретението са изобретени две техники за секвениране на ДНК за по-дълги молекули на ДНК: методът Сангер (или дидеокси) и методът Максам-Гилбърт (химическо разцепване). Методът Maxam-Gilbert се основава на специфично нуклеотидно разцепване от химикали и се използва най-добре за секвениране на олигонуклеотиди (къси нуклеотидни полимери, обикновено по-малки от 50 основни двойки по дължина). Методът Сангер е по-често използван, тъй като е доказано технически по-лесно да се приложи и с появата на PCR и автоматизация на техниката, лесно се прилага върху дълги нишки на ДНК, включително някои цели гени. Тази техника се основава на прекъсване на веригата от дидеоксинуклеотиди по време на реакциите на PCR удължаване.
Сангер метод
В метода на Сангер, ДНК веригата, която трябва да се анализира, се използва като шаблон и ДНК полимераза се използва в PCR реакция за генериране на допълнителни вериги с помощта на праймери. Приготвят се четири различни PCR реакционни смеси, всяка съдържаща определен процент аналози на дидеоксинуклеозид трифосфат (ddNTP) към един от четирите нуклеотиди (ATP, CTP, GTP или TTP).
Синтезът на новата верига на ДНК продължава, докато не бъде включен един от тези аналози, по това време веригата е преждевременно съкратена. Всяка PCR реакция в крайна сметка ще съдържа смес от различни дължини на ДНК вериги, всички завършващи с нуклеотида, който е белязан с дидеокси за тази реакция. гел електрофореза след това се използва за разделяне на нишките на четирите реакции в четири отделни ленти и определяне на последователността на оригиналния шаблон въз основа на това какви дължини на нишките завършват с какъв нуклеотид.
В автоматизираната реакция на Сангер се използват грундове, които са етикетирани с четири различни цветни флуоресцентни маркера. PCR реакциите, в присъствието на различните дидеоксинуклеотиди, се извършват, както е описано по-горе. След това, четирите реакционни смеси след това се комбинират и се прилагат върху една лента на гел. Цветът на всеки фрагмент се открива с помощта на лазерен лъч и информацията се събира от компютър която генерира хроматограми, показващи пикове за всеки цвят, от които може да бъде последователността на ДНК на шаблона определено.
Обикновено методът на автоматизирано секвениране е точен само за последователности с дължина до максимум около 700-800 базови двойки. Възможно е обаче да се получат пълни последователности от по-големи гени и всъщност цели геноми, като се използват стъпка-разумни методи като праймер ходене и изстрелване на пушка.
При групово ходене работеща част от по-голям ген се секвенира чрез метода на Сангер. Нови праймери се генерират от надежден сегмент от последователността и се използват за продължаване на секвенцията на частта от гена, която е извън обхвата на първоначалните реакции.
Последователността на пушката води до произволно разрязване на интересуващия ДНК сегмент на по-подходящи (управляеми) фрагменти с размер, подреждане на всеки фрагмент и подреждане на парчетата въз основа на припокриване последователности. Тази техника е улеснена чрез прилагането на компютърен софтуер за подреждане на припокриващите се парчета.