Процес на оцветяване по грам в микробиологията

Петното по Грам е диференциален метод за оцветяване, използван за присвояване бактерии към една от две групи (грам-положителни и грам-отрицателни) въз основа на свойствата на техните клетъчни стени. Известно е още като оцветяване по Грам или метод на Грам. Процедурата е кръстена на лицето, разработило техниката, датския бактериолог Ханс Кристиан Грам.

Процедурата се основава на реакцията между пептидогликан в клетъчните стени на някои бактерии. Петното по Грам включва оцветяване на бактерии, фиксиране на цвета с морда, обезцветяване на клетките и прилагане на контраст.

1. Основното петно ​​(кристално виолетово) се свързва с пептидогликан, като оцветява клетките в лилаво. Както грам-положителните, така и грам-отрицателните клетки имат пептидогликан в клетъчните си стени, така че първоначално всички бактерии оцветяват виолетово.
2. Йод на Грам (йод и калиев йодид) се прилага като разтвор или фиксатор. Грам-положителните клетки образуват кристално виолетово-йоден комплекс.
instagram viewer
3. алкохол или ацетон се използва за обезцветяване на клетките. Грам-отрицателните бактерии имат много по-малко пептидогликан в клетъчните си стени, така че тази стъпка по същество ги прави безцветни, докато само част от цвета се отстранява от грам-положителните клетки, които имат повече пептидогликан (60-90% от клетъчната стена). Дебелата клетъчна стена на грам-положителните клетки се дехидратира чрез стъпката на обезцветяване, което води до тяхното свиване и задържане на петното-йодния комплекс вътре.
4. След стъпката на обезцветяване се прилага контрастайн (обикновено сафранин, но понякога и фуксин) за оцветяване на бактериите в розово. Както грам-положителните, така и грам-отрицателните бактерии вземат розовото петно, но то не се вижда над по-тъмното лилаво на грам-положителните бактерии. Ако процедурата на оцветяване се извърши правилно, грам-положителните бактерии ще бъдат лилави, докато грам-отрицателните бактерии ще бъдат розови.

Резултатите от оцветяването по Грам се преглеждат с помощта на светлинна микроскопия. Тъй като бактериите са оцветени, не само се идентифицира тяхната група оцветяване по Грам, но и формата имможе да се наблюдава модел, размер и струпване. Това прави петното по Грам ценно диагностично средство за медицинска клиника или лаборатория. Докато петното може да не идентифицира определено бактериите, често знаем дали са грам-положителни или грам-отрицателни е достатъчно за предписване на ефективен антибиотик.

Някои бактерии могат да бъдат грам-променливи или грам-неопределени. Въпреки това, дори тази информация може да бъде полезна за стесняване на бактериалната идентичност. Техниката е най-надеждна, когато културите са на възраст под 24 часа. Въпреки че може да се използва на бульонни култури, най-добре е първо да ги центрофугирате. Основното ограничение на техниката е, че тя дава грешни резултати, ако се правят грешки в техниката. Необходими са практика и умения, за да се постигне надежден резултат. Също така инфекциозният агент може да не е бактериален. Еукариотичните патогени оцветяват грам-отрицателни. Въпреки това, повечето еукариотни клетки освен гъбичките (включително дрождите) не успяват да се придържат към слайда по време на процеса.

• Кристално виолетово (първично петно)
• Йодът на Грам (мордант, за фиксиране на кристално виолетово в клетъчната стена)
• Етанол или ацетон (обезцветител)
• Сафранин (вторично петно ​​или контрастно)
• Вода в шишенце или бутилка с капкомер
• Микроскопски пързалки
• Съставен микроскоп

1. Поставете малка капка бактериална проба върху слайд. Топлината фиксира бактериите към слайда, като го предава три пъти през пламъка на Bunsen горелка. Прилагането на твърде много топлина или твърде дълго може да стопи клетките на стените на бактериите, изкривявайки формата им и да доведе до неточен резултат. Ако се приложи твърде малко топлина, бактериите ще отмият пързалката по време на оцветяването.
2. Използвайте капкомер, за да нанесете основното петно ​​(кристално виолетово) върху пързалката и го оставете да седи за 1 минута. Внимателно изплакнете пързалката с вода не повече от 5 секунди, за да премахнете излишното петно. Изплакването твърде дълго може да премахне твърде много цвят, докато не изплакнете достатъчно дълго, може да позволи твърде много петна да остане върху грам-отрицателните клетки.
3. Използвайте капкомер, за да нанесете йод на Грам върху слайда, за да фиксирате кристалната виолетка към стената на клетката. Оставете го да преседи 1 минута.
4. Изплакнете пързалката с алкохол или ацетон за около 3 секунди, последвано веднага с леко изплакване, като използвате вода. Грам-отрицателните клетки ще загубят цвят, докато грам-положителните клетки ще останат виолетови или сини. Ако обаче обезцветителят се остави твърде дълго, всички клетки ще загубят цвета си!
5. Нанесете вторичното петно, сафранина и го оставете да престои 1 минута. Нежно изплакнете с вода не повече от 5 секунди. Грам-отрицателните клетки трябва да бъдат оцветени в червено или розово, докато грам-положителните клетки все още ще изглеждат лилави или сини.
6. Вижте слайда с помощта на сложен микроскоп. Може да е необходимо увеличение от 500x до 1000x, за да се разграничат формата и разположението на клетките.

Не всички бактерии, идентифицирани чрез оцветяването по Грам, са свързани с болести, но няколко важни примера включват:

• Грам-положителни коки (кръгли):Стафилококус ауреус
• Грам-отрицателни коки:Neisseria meningitidis
• Грам-положителни бацили (пръчки): Bacillus anthracis
• Грам-отрицателни бацили:Ешерихия коли